Журнал Микробиологии.-2002.-№2.-С.83-89

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНДОТОКСИНА ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2002


В. М. Бондаренко, В.Г.Лиходед, М.Ю.Яковлев

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Институт общей и клинической патологии, Москва

Полученные в последние годы новые дан­ные о важной роли липополисахаридов (эндотоксина) грамотрицательных бактерий в физиологии и патогенезе важнейших заболеваний человека, как инфекционного, так и неинфекционного генеза, определяют необходимость широких клинических испытаний самых различных методов обнаружения ЛПС в крови и других биологических жидкостях. Из имеющихся на сегодняшний день методов диагностики эндотоксинемии примене­ние находит высокочувствительный ЛАЛ-тест в самых разнообразных модификациях. Известна неспецифичность ЛАЛ-теста, мно­гие недостатки которого успешно преодоле­ны. Приведенные результаты клинических исследований по определению активности ЛПС в системном кровотоке и титров анти­тел к его наиболее общим детерминантам, а также резервы связывания эндотоксина гранулоцитами позволяют с оптимизмом оценивать перспективу дальнейшего изуче­ния роли ЛПС в физиологии и патологии че­ловека. В клинической практике необходи­мо учитывать как положительные моменты, так и недостатки при применении известных в настоящее время методов определения ЛПС, в том числе и ЛАЛ-теста, для комплек­сной оценки показателей эндотоксинемии.

 

Ключевые слова: липополисахариды, эндоток­сины, грамотрицательные бактерии, методы определения, физиологическая эндотоксинемия

 

DETECTION OF THE ENDOTOXIN OF GRAM NEGATIVE BACTERIA IN HUMAN BLOOD

V.M. Bondarenko, V.G. Likhoded, М. Yu. Yakovlev

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Institute of General and Clinical Pathology, Moscow, Russia

Recent new data on the important role played by lipopolysaccharides (endotoxin) of Gram negative bacteria in physiology and pathogenesis of the most important human in­fectious and noninfectious diseases testify to the necessity of wide clinical trials of different methods for LPS detection in blood and other physiological fluids. Among presently available diagnostic methods for endotoxinemia detec­tion, the highly sensitive LAL (Limulus Amebo-cyte Lysate) test in various modifications is most widely used. The LAL test is known to be non­specific, however many drawbacks of this test have been successfully overcome. The results of clinical studies on the determination of the LPS activity in the systemic blood stream and antibody titers to its most common determi­nants, as well as the reserves of endotoxin bind­ing with granulocytes give grounds for optimis­tic evaluation of the future studies on the role of LPS in human physiology and pathology. In clinical practice both positive sides and draw­backs of the presently known methods for LPS detection, including the LAL test, must be borne in mind for the complex evaluation of endotox­inemia levels.

 

Key words: lipopolysaccharides, endotoxins, Gram negative bacteria, detection methods, physiological endotoxinemia

Эндотоксином (ЭТ) называют липополисахарид (ЛПС) внешней мембраны кле­точной стенки грамотрицательных (Гр) бактерий. В отличие от экзотоксинов ЛПС выделяется во внешнюю среду в основном при разрушении бактериальных клеток. Существует также свободный эндотоксин, продуцируемый бактериями во внешнюю среду и обнаруживаемый в супернатантах бульонных культур. Однако его количество сравнительно невелико.

Эндотоксину посвящено огромное ко­личество публикаций, включающих экспериментальные исследования, клиничес­кие наблюдения, обзоры и монографии. В частности, в 1984 г. издано 4-томное ру­ководство по эндотоксинам [23], а в 1999 г. вышел в свет сборник "Endotoxin in Health and Disease", содержащий 64 раз­дела публикаций обзорного типа ведущих специалистов по различным аспектам структуры, биосинтеза, биологической активности и роли эндотоксина в физио­логии и патологии человека [20]. В 1988 г. создано Международное эндотоксиновое общество, которое в 1994 г. основало Journal of Endotoxin Research и провело уже 6 международных конференций, посвя­щенных рассмотрению новых достижений в области эндотоксинологии.

Большой интерес исследователей к ЭТ обусловлен не только его уникальной структурой и весьма широкой по разно­образию вызываемых эффектов биологической активностью, но и тем обстоятель­ством, что человек находится в постоян­ном контакте с ЭТ, так как в его кишеч­нике обитает довольно большое количе­ство грамотрицательных бактерий.

Сравнительно недавно при помощи иммунофлюоресцентного метода было впервые показано, что ЭТ может быть обнаружен на поверхности гранулоцитов в крови новорожденных, их матерей и других практически здоровых людей [11, 17]. Применение иммуноэнзимной техно­логии позволило затем показать, что в тон­ких мазках крови здоровых людей обнару­живается около 3% полиморфноядерных лейкоцитов, связавших эндотоксин в кро­вотоке обследуемых при помощи Fc-зависимого механизма. Кроме того, еще около 5% лейкоцитов способны связывать эндо­токсин in vitro, то есть у здоровых людей имеются резервы связывания эндотокси­на лейкоцитами [5, 6]. ЭТ был обнаружен также в плазме крови. практически здоровых людей [31, 35]. E.T. Rietschel и O. Westphal [40] полагают, что эндотоксин может играть определенную роль в физиологии человека, и приводят расчетные  данные о том, что каждый человек постоянно контактирует с грамовыми количествами эндотоксина, и в его плазме крови содержится примерно 3-10 пкг эндотоксина в мл. Более детально вопрос о роли эндо­токсина в физиологии и патологии чело­века рассматривается в публикациях оте­чественных исследователей, которые полагают, что в норме у человека проник­новение низких доз ЭТ приводит к разви­тию системной эндотоксинемии, которая обеспечивает поддержание всех частей иммунной системы в состоянии физиоло­гического тонуса и адаптацию макроорга­низма к изменяющимся условиям [16, 17]. При стрессовых состояниях и различных заболеваниях может наблюдаться увели­ченное поступление ЭТ в кровоток и снижение антиэндотоксинового иммунитета, что приводит к развитию эндотоксиновой агрессии, то есть к проявлению патоген­ного действия ЭТ [18].

Эти положения находят свое подтверж­дение во многих работах, в которых пока­зано снижение антиэндотоксинового им­мунитета и участие ЭТ в патогенезе раз­личных инфекционных и неинфекцион­ных заболеваний, таких как гестозы, эк­лампсия, острые вирусные респираторные заболевания, гепатиты, атеросклероз и инфаркт миокарда, сепсис и многие дру­гие [1, 2, 4, 8, 9, 13, 14, 22, 27, 28, 49].

Эти материалы указывают на очевидную целесообразность диагностики эндотокси­немии при различных видах патологии. К сожалению, диагностика эндотоксинемии в наших учреждениях проводится очень редко. В связи с этим, необходимо корот­ко рассмотреть и оценить известные ме­тоды обнаружения ЭТ в кровотоке. В принципе для обнаружения ЭТ могут быть использованы методы, основанные на выявлении уникальных структурных компанентов ЛПС (1), иммунологические методы (2), способы с использованием веществ, связывающих ЛПС (3) и методы, основанные на выявлении биологической активности ЭТ (4).

Методы обнаружения ЭТ, основанные на выявлении его уникальных структурных компонентов. В этом разделе необходимо от­метить, прежде всего, возможность исполь­зования таких уникальных компонентов ЛПС как β-гидроксимиристиновая кислота и КДО — кетодезоксиоктулозоновая кис­лота в качестве химических маркеров, позволяющих определить присутствие и количество ЭТ. Для выявления и оценки количества β-гидроксимиристиновой кис­лоты были использованы такие трудоем­кие методы как выделение и гидролиз ЛПС, газ-хроматография и масс-спектрометрия [33,34]. Наличие и количество КДО может быть определено тиобарбитуровым методом или при помощи спин-резонан­са также после выделения ЛПС [30,46,48]. Несмотря на достаточно высокую точность определений, все эти методы практичес­ки не применимы в рутинных лабораторно-клинических исследованиях [3, 9].

Иммунологические методы обнаружения ЭТ. В принципе, ЛПС является хорошим антигеном и вызывает обычно формиро­вание нескольких классов антител в дос­таточно высоких титрах. Однако ЭТ обыч­но используют для выявления антиэндотоксиновых антител, в то же время пря­мое определение ЭТ при помощи антител характеризуется низкой чувствительнос­тью, не позволяющей выявлять концент­рации ЛПС менее 0,1 мкг/мл [6, 21, 29, 37]. Тем не менее, иммунологические ме­тоды могут быть использованы в комби­нации с другими приемами. Один из та­ких методов включает использование мы­шиных моноклональных антител класса IgM против липида А. При добавлении этих антител к цельной крови, содержащей ЛПС, формируется комплекс антитело-эндотоксин, который, взаимодействуя с рецепторами нейтрофилов, связывает ком­племент, опсонизированный зимозаном, и индуцирует продукцию нейтрофилами оксиданта, вызывающего окисление лю­минала и последующую эмиссию света, то есть люминолзависимую люминесценцию. Успешность воспроизведения этой реак­ции зависит от оптимального соотноше­ния антител и ЭТ. Для количественного определения ЭТ этим методом необходи­мо проведение позитивного контроля с определенным соотношением ЛПС и антител. Результаты определения ЭТ этим методом были хорошо воспроизводимы при концентрации ЛПС 0,017 — 1,6 EU/ мл или 20 — 2000 пкг/мл, то есть метод характеризуется достаточно высокой чув­ствительностью [41].

Способы обнаружения с использованием веществ, связывающих ЭТ. Известно, что антибиотик полимиксин В обладает вы­раженной способностью связывать ЛПС, и эта способность была использована для разработки методов выявления ЭТ [43,45]. В частности, был приготовлен конъюгат Fab-фрагментов антител к гликофорину эритроцитов (SimpliRED Endotoxin Test), которые связываются с поверхностными структурами эритроцитов, но не вызыва­ют гемагглютинацию. Однако если в кро­ви присутствует ЭТ, он связывается с фик­сированными на эритроцитах конъюгированными антителами и обусловливает тем самым развитие хорошо выраженной гемагглютинации [32, 45]. SimpliRED-тест характеризуется довольно высокой чув­ствительностью (1,2 EU/мл).

Другим примером из этой области яв­ляется использование белка, нейтрализу­ющего ЭТ (ENP). Этот белок, выделенный из лизата амебоцитов краба рода Limulus, обладает высоким сродством к ЛПС. По­лученный методами молекулярной биотех­нологии рекомбинантный белок rENP был помечен флюоресцентом и затем исполь­зован в приборе PolarScan для количествен­ного определения ЭТ по изменению поляризации флюоресценции [44]. Исполь­зуя стандартную кривую с очищенным ЭТ, авторы определили, что способ воспроизводимо выявляет ЭТ при его содержании не менее 5 EU/мл. Возможности широко­го использования метода ограничены не­обходимостью выделения и очистки бел­ка ENP, использования прибора PolarScan, а также необходимостью обработки иссле­дуемых образцов ультразвуком для дезагрегации ЭТ и более точного его опреде­ления.

Для выявления ЭТ могут быть исполь­зованы и некоторые другие белки, обла­дающие сродством к ЛПС [36].

Определение ЭТ по выявлению его биоло­гической активности. Наиболее известным и широко используемым в фармации яв­ляется так называемый пирогенный тест, основанный на способности ЭТ при внут­ривенном введении вызывать у кроликов температурную реакцию. Хотя этот тест может быть использован для количествен­ного определения ЛПС [50], однако его достаточно высокая стоимость, необходи­мость строгого контроля за животными и возможная вариабельность их ответа зат­рудняют его применение в клинической лабораторной практике.

Недавно описан новый пирогенный тест, в котором используется цельная кровь здоровых доноров [24]. При инкубации пробы этой крови с исследуемым образ­цом, содержащим пироген, в лейкоцитах индуцируется синтез интерлейкина-1, на­личие которого выявляется иммуноэнзимным способом. Способ, однако, выявляет не только ЭТ, но и некоторые другие био­логически активные полимеры.

Способ количественного определения ЭТ по гибели животных характеризуется низ­кой чувствительностью [38] и также мало пригоден для использования в диагности­ке. Возможны также способы определения ЭТ по его способности вызывать у чувстви­тельных животных определенные измене­ния, например, повышать содержание в плазме крови некоторых белков острой фазы, в частности, сывороточного амило­ида [39]. Применение таких методов так­же крайне ограничено.

Более перспективны методы, основан­ные на оценке различных биологических эффектов, вызываемых ЭТ в культурах клеток человека, например, макрофагов, лейкоцитов, моноцитов периферической крови [36]. Плохая воспроизводимость этих методов ограничивает пока возмож­ности их диагностического применения. Более воспроизводим недавно предложен­ный метод определения ЛПС путем изме­рения продукции NO в макрофагах мыши линии RAW [25]. Метод довольно чувстви­телен, однако до сих пор в диагностичес­кой практике не применялся.

Наиболее широкое применение в прак­тике выявления ЭТ нашел тест с лизатом амебоцитов краба Limulus poliphemusLimulus Amebocyte Lysate (LAL). Этот так называемый LAL-тест основан на способ­ности ЭТ вызывать коагуляцию некоторых белков, содержащихся в лизате амебоци­тов [35]. Он широко применяется для об­наружения ЭТ в фармацевтической прак­тике и с этой целью включен в фармако­пеи целого ряда стран, в том числе и в фармакопею Российской Федерации [10]. LAL-тест характеризуется очень высокой чувствительностью (5 пкг/мл или 0,06 EU/ мл, 1 нг = 12 Endotoxin Units) [19], а его так называемая хромогенная модификация еще более чувствительна (0,001 — 0,005 EU/мл) [30]. В связи с этим, возможность применения LAL-теста в диагностике привлекала и привлекает повышенное внимание многих исследователей [26 — 28, 35]. Тем не менее, официальное исполь­зование LAL-теста в клинической прак­тике до настоящего времени разрешено только в Японии, хотя этот метод был применен в целом ряде исследований и довольно интенсивно обсуждается [26 — 28,31,35].

В чем же причины отсутствия офици­ального признания LAL-теста как метода диагностики эндотоксинемии? Это объяс­няется, прежде всего, наличием довольно сложных взаимоотношений между ЭТ, LAL и компонентами крови человека. Поступая в кровоток, ЭТ может взаимо­действовать со многими клетками крови и компонентами плазмы крови, включая различные лейкоциты, тромбоциты, соли желчных кислот, различные протеины и липопротеины. Эти взаимодействия могут давать прямо противоположные результа­ты. Связывание ЭТ с лейкоцитами и тром­боцитами, с антителами и липопротеинами высокой удельной плотности, с белком LBP, связывающим ЛПС (LPS binding protein), или с бактерицидным белком BPI (bactericidal/permeability increasing protein), увеличивающим проницаемость бактери­альной клетки, может приводить к умень­шению показателей реакции в LAL-тесте. Такой же эффект дает взаимодействие ЭТ с гепарином. Наоборот, взаимодействие с солями жирных кислот может способство­вать дезагрегации частиц ЛПС и, в конеч­ном итоге, увеличению показателей LAL-теста. На показатели LAL-теста может се­рьезно влиять также контаминация лабо­раторной посуды и реактивов некоторы­ми экзогенными продуктами бактерий и грибов (ЛПС и глюканами), которые так­же увеличивают показатели LAL-теста. Правда, глюканы грибов реагируют с LAL в значительно более высоких концентра­циях, чем ЛПС.

Обобщая изложенное выше, необходи­мо отметить возможное наличие в крови или в посуде и реагентах факторов, ингибирующих или активирующих реакцию ЭТ с LAL. Поэтому при постановке LAL-тес­та для получения более точных результа­тов необходимо обеспечить: 1) высвобож­дение связанного ЭТ, 2) инактивацию компонентов, позитивно или отрицательно влияющих на показатели реакции пу­тем разведения, прогревания или обработ­ки перхлористой кислотой, 3) концентра­цию ЭТ и других факторов, например, дивалентных катионов, оптимальную для реакции ЭТ с LAL. При этом нужно учи­тывать, что некоторые антибиотики, в частности, аминогликозиды и пенициллин также интерферируют с LAL-тестом [44]. Детально техника обработки образцов и постановки реакции с LAL описана в ряде публикаций [27, 35, 41, 42, 47].

При анализе результатов LAL-теста сле­дует иметь также в виду возможную индивидуальную вариабельность в количествен­ном содержании ингибирующих и активирующих факторов у различных пациен­тов и в различных лабораторных условиях. Коэффициент вариабельности резуль­татов теста достаточно высок (около 50%). Кроме того, количественные результаты LAL-теста определяются путем сравнения со стандартной кривой, полученной при использовании референс-эндотоксина, например ЛПС Escherichia coli, однако эндотоксины разных видов бактерий (на­пример, ЛПС сальмонелл и ЛПС псевдо­монад) обладают различной способностью активировать компоненты лизата амебо­цитов.

Авторы [19, 22, 26 - 28, 35, 37, 38], подвергавшие анализу результаты применения LAL-теста в клинике, делают зак­лючение о необходимости осторожной интерпретации данных, полученных при помощи LAL-теста, так как нет строгой корреляции между содержанием ЭТ в кро­ви и тяжестью клинических явлений, а также с прогнозом дальнейшего развития заболеваний. В связи с этим необходимо обратить внимание на одностороннюю оценку роли показателей эндотоксинемии в клинических Исследованиях. Практичес­ки во всех работах зарубежные авторы учи­тывали только показатели эндотоксинемии и не принимали во внимание, даже не изучали показатели антиэндотоксинового иммунитета. В то же время наши данные свидетельствуют о том, что показатели антиэндотоксинового иммунитета играют очень важную роль при самых различных заболеваниях [1, 4, 6, 13, 18]. Тяжесть кли­нического течения и прогноз развития заболеваний, безусловно, зависят от соот­ношений между показателями эндотокси­немии и состоянием антиэндотоксиново­го иммунитета. Поэтому правильная оцен­ка роли эндотоксинемии возможна только при одновременном определении по­казателей и эндотоксинемии и антиэндотоксинового иммунитета.

Изучение материалов литературы и соб­ственных исследований позволяет сделать заключение, что для диагностики эндоток­синемии в настоящее время наиболее широкое применение нашел высокочув­ствительный LAL-тест, хотя он и облада­ет рядом недостатков. Вместе с тем, более широкому изучению подлежат и некото­рые новые тесты, например SimpliRED Endotoxin Test [43] и тест с использовани­ем люминолзависимой люминесценции при добавлении к цельной крови антител к липиду А [41].

ЛИТЕРАТУРА

1.     Анохин В.А., Бондаренко В.М., Уразаев Р.А. и др. Гуморальный иммунный ответ к анти­генам транзиторной кишечной аутофлоры при острых респираторных вирусных инфекциях у детей. Журн. микробиол. 1994, 6:41 — 43.

2.     Аполлонин А.В., Рудик А.А., Кропачева Е.И. и др. Динамика титров антител к Re-гликолипиду у пациентов с перитонитом в про­цессе антиэндотоксиновой терапии. Там же: 88 - 89.

3.            Денисова Л.Я., Батурина И.И., Закабунин А.И. и др. Определение примесей липополисахаридов в препаратах белков. Там же. 1999,5: 109- 112.

4.            Дмитриева Е.В., Аполлонии А.В., Лиходед В.Г. и др. Функциональная активность антиэндотоксиновых факторов при вирусных гепатитах А и В. Вестн. РАМН. 1995, 12: 38 -41.

5.            Лиходед В.Г., Аниховская И.А., Аполлонин А.В. и др. Fc-зависимое связывание эндотоксинов грамотрицательных бактерий полиморфноядерными лейкоцитами крови человека. Журн. микробиол. 1996, 6: 76 — 79.

6.            Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю., Аполлонии А.В. и др. Способ оценки антиэндотоксинового иммунитета относительно грамотрицатель­ных бактерий (ЛПС-тест-ИФА). Патент РФ № 2088936, 1997.

7.     Лиходед В.Г., Чхаидзе И.Г., Галдавадзе М.А. и др. Развитие кишечного дисбактериоза у новорожденных детей при недостаточности антител к Re-гликолипиду. Журн. микробиол. 1998,4:67-68.

8.     Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю., Мосежный А.Е. и др. Антиэндотоксиновый иммунитет в физиологии и патологии человека. Мед. эк­стремальных ситуаций. 1999, 1: 22 — 26.

9.     Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Воробьев А.А. и др. Бактериальная эндотоксинемия у
детей при кишечных дисбактериозах. Журн. микробиол. 1999, 3: 67 — 70.

10.    Общая фармакопейная статья ОФС 42-0002-00.Бактериальные эндотоксины.

11.    Серов В.Н., Бондаренко Е.В., Яковлев М.Ю. и др. Иммуноморфологическая диагностика эндотоксинемии в акушерской и гинеколо­гической практике. Труды НИИ эпидеми­ологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. М., 1987, с. 128- 131.

12. Таболин В.А., Бельчик Ю.Ф.,ЧабаидзеЖЛ. и др. Показатели антиэндотоксинового иммунитета у новорожденных в норме и патологии. Международн. журн. иммунореабил. 2000, 1: 131- 137.

13.    Уразаев Р.А., Крупник А.А., Яковлев М.Ю. Эндотоксинемия в раннем периоде адапта­ции новорожденных и их матерей. Казан, мед. журн. 1992,2: 114 - 118.

14.    Уразаев Р.А., Яковлев М.Ю., Аниховская И.А. и др. Способ оценки резистентности организма (SOIS-IFA). Патент РФ №2011913,1994.

15.    Ющук Н.Д., Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю. и др. Титры антител к гликолипиду хемотипа Re и связывание эндотоксина лейкоци­тами при гнойных менингитах. Журн. микробиол. 1996, 6:52-53.

16.    Яковлев М.Ю. Роль кишечной микрофло­ры и недостаточности барьерной функции печени в развитии эндотоксинемии и вос­паления. Казан, мед. журн. 1988, 5: 353 — 358.

17.    Яковлев М.Ю., Лиходед В.Г., Крупник А.А. и др. Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий. А.с. № 1749758, 1992.

18.    Яковлев М.Ю., Лиходед В.Г., Аниховская И.А. и др. Использование показателей ан­тиэндотоксинового иммунитета для объек­тивной оценки резистентности организма и эффективности терапии. Мед. журн. Рос­сии. 1998,2: 139 - 143.

19.    Cohen J. The detection and interpretation of endotoxemia. Intens. Care Med. 2000,26 (sup-pl.I): 51 — 56.

20.    Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999.

21.    Fink P.C., Galanos C. Determination of anti-lipid A and lipid A by enzyme immunoassay. Immunobiology. 1981, 158: 380 - 390.

22.    Fink M.P., Mythen M.G. The role of gut-de­rived endotoxin in the pathogenesis of multi­ple organ dysfunction. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al; (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 855 - 864.

23.    Handbook of endotoxin. R. Proktoret al. (ed.). Elsevier Press, Amsterdam-New-York-Oxford, 1984.

24.    Hartung Т., Fennrich S., Wendel A. Detec­tion of endotoxin and other pyrogens by hu­man whole blood. J. Endotox. Res. 2000,6 (2): 184.

25.    Hitchins V.M., Neale A.R., Merritt K. Detec­tion of lipopolysaccharide by measuring nitric acid production in murine macrophage cells. Ibid: 101 - 102.

26.    Hurley J.C. Concordance of endotoxemia with gram-negative bacteria in patients with gramnegative sepsis: a meta-analysis. J. Clin. Micro­biol. 1994,32:2120-2127.

27.    Hurley J.C. Endotoxemia: methods of detec­tion and clinical correlates. Clin. Microbiol. Rev. 1995, 8: 268 - 292.

28.    Hurley J.C, Levin J. The relevance endotoxin detection in sepsis. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 841-854.

29.    Gutowski J.A., Jacobs D.M. A solid phase ra­dioimmunoassay for bacterial lipopolysaccha­ride. Immunol. Commun. 1979, 8: 347 - 364.

30.    Karkhanis Y.D., Zeltner J.Y., Jackson J.J. et al. A new and improved microassay to deter­mine 2-keto-3-desoxyoctonate in lipopolysac­charide of gram-negative bacteria. Annal. Bi-ochem. 1978,85:595-601.

31.    Ketchum P.A., Parsonnet J., Stotts L.S. et al. Utilization of a chromogenic Limulus amebocyte lysate blood assay in a multi-center study of sepsis. J. Endotox. Res. 1997, 4: 9 — 16.

32.    Koleff M.H., Eisenberg P.R. A rapid qualita­tive assay to detect circulating endotoxin can predict the development of multiorgan dysfunc­tion. Chest. 1997, 112(1): 173- 180.

33.    Maitra S.K., Schotz M.C., Yoshikawa T.T. et al. Determination of lipid A and endotoxin in serum by mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978, 75: 3993 - 3997.

34.    Maitra S.K., Nachum R., Pearson F.C. Estab­lishment of meta-hydroxy fatty acids as a chem­ical marker molecules for bacteria endotoxin by gas chromatography-mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 1986, 52: 510 — 514.

35.    Novitsky T.J. Limulus amebocyte lysate (LAL) detection of endotoxin in human blood. J. En­dotox. Res. 1994, 1:253-263.

36.    NovitskyT.J. Endotoxin detection in body flu­ids: Chemical versus bioassay methodology. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 831 - 839.

37.    Pedron Т., Girard R., Kosma P. et al. Prepa­ration and binding specifity of a monoclonal antibody recognizing-3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid (KDO) in lipopptysaccharides of Re chemotype. Hibridoma.1992, 11:765 — 777.

38.    Pieroni R.E., Broderick E.J., Bundeally A. et al. A simple method for the quantitation of sub-microgram amounts of bacterial endotoxin. Proc. Soc. Exp. Med. 1970, 133: 790 - 794.

39.    Poole S., Gaines Das R.E., Baltz M. et al. De­tection of endotoxin in mice by measurement of endotoxin-induced changes in plasma con­centration of zinc and of the acute-phase pro­tein serum amyloid P-component. J. Pharm. Pharmacol. 1986, 38: 807 - 810.

40.    Rietschel E., Westphal O. Endotoxin: histori­cal perspectives. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 1 - 30.

41.    Romashin A.D., Harris D.M., Ribeiro M.B. et al. A rapid assay of endotoxin using autologous neutrophil dependent chemiluminescence. J. Immunol. Method. 1998, 212 (2): 169 - 185.

42.    Roth R.I., Levin F.C, Levin J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with Limulus test. J. Lab. Clin. Med. 1990,116: 153- 161.

43. Rylatt D., Wilsin K., Kemp B.E. et al. A rapid test for endotoxin in whole blood. In: Bacteria Endotoxin: Lipopolysaccharides from Genes to Therapy. New York, Wiley-Liss, Inc., 1995, p. 273 - 284.

44.    Sloyer J., Novitsky T. Use of rENP to quantitate endotoxin by fluorescence polarisation. J. Endotox. Res. 2000, 6 (2): 101.

45.    Smith N.L. A field test for endotoxin in the horse. Vet. Rev. 1993, 13: 433 - 440.

46.    Strain S.M., Armitage I.M. Selective detection of 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid in in­tact lipopolysaccharides by spin-echo NMR. J. Biol. Chem. 1985, 260: 12974 - 12977.

47.    Sullivan J.D., Watson S.W. Inhibitory effect of heparin on the limulus test of endotoxin. J. Clin. Microbiol. 1975, 2: 151-155.

48. Unger F.M. The chemistry and biological singificance of 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid (KDO). Advanc. Carbohydr. Chem. Biochem. 1981,38:323-387.

49.    Wiederman C.J., Kiechl S., Dunzendorfer S. et al. Endotoxin and atherosclerosis. J. Endotox. Res. 2000, 6 (2): 86.

50. Wolf S.M., Mulholland J.H., Ward S.B. Quantitative aspects of the pyrogenic response of rabbit to endotoxin. J. Labor. Clin. Res. 1965, 65: 268 - 275.

Поступила 30.06.01