Казанский мед.-1992.-№2.-С.114-118.

УДК 616-053.31:576.8.097.29

ЭНДОТОКСИНЕМИЯ В РАННЕМ ПЕРИОДЕ АДАПТАЦИИ НОВОРОЖДЕННЫХ И  ИХ МАТЕРЕЙ

Р. А. Уразаев, А. Н. Крупник, М. Ю. Яковлев

Лаборатория патанатомии экстремальных состояний (руковод.—акад. АМН СССР, проф. И. К. Пермяков), сектор перспективных исследований НПФ "Мечников" (руковод.—канд. мед. наук. М. Ю. Яковлев) Института морфологии человека АМН СССР, кафедра детских болезней лечебного факультета (научн. консульт.проф. Е. В. Белогорская), кафедра биохимии (зав.—акад. АН ТССР, проф. Д. М. Зубаиров) Казанского ордена Трудового Красного Знамени медицинского института имени С. В. Курашова


В раннем периоде адаптации у всех новорожденных при формировании аутофлоры развивается транзиторный дисбактериоз, связанный с колониза­цией респираторного и кишечного трак­та, условно-патогенными микроорга­низмами, в частности энтеробактериями (эшерихиями, клебсиеллами, энтеробактером)  и золотистыми стафило­кокками [5]. Нарушение микроэколо­гии сопровождается гибелью антаго­нистически активных бактерий и раз­витием токсинемии с потреблением специфических антител, что может привести  к снижению резистентности к инфекциям, особенно   грамотрицательной этиологии [8].     Патогенный эффект возбудителей этих заболеваний обусловлен высвобождающимся из микробов эндотоксином [15]. При си­стемной эндотоксинемии развиваются гипогликемия и ацидоз, нарушаются терморегуляция, деятельность ЦНС, желудочно-кишечного тракта и функ­ция почек [14]. Изменения в указан­ных органах и системах, отражающие процесс адаптации, часто наблюдают­ся в периоде новорожденности. На возможную  этиологическую роль эн­дотоксина в развитии некоторых по­граничных состояний у новорожденных указывают ряд авторов [3, 5, 6]. Однако в литературе нет каких-либо конкретных данных о содержании эндо­токсина у новорожденных в первые дни жизни и специфических защитных реакциях в ответ на антигенную стимуляцию.

Состояние антиэндотоксинового иммунитета можно оценивать по содержанию антител к гликолипиду Re-мутантов энтеробактерий. Гликолипид хемотипа Re, состоящий из липида А и трех молекул кетодезоксиоктановой кислоты, является обязательным ком­понентом липополисахарида  внешней мембраны большинства    грамотрицательных бактерий и может служить   в качестве маркера эндотоксина [1, 14].

Целью исследований было установ­ление взаимосвязи между развитием адаптационных реакций в раннем неонатальном периоде и содержанием в плазме новорожденных и их матерей эндотоксина и антител к Re-гликолипиду энтеробактерий. Для оценки состояния иммунной системы определя­ли титр антител против кишечной па­лочки и золотистого стафилококка.

Под наблюдением находились 38 до­ношенных новорожденных и 37 матерей. При группировке    клинического материала учитывали состояние здоровья детей при рождении и характер течения периода ранней     адаптации. В 1-ю контрольную группу вошел 21 новорожденный  с оценкой  состояния по шкале Апгар в 8—9 баллов, с массой тела от 3000 до 5000 г.   К груди детей прикладывали на  1—2-е сутки, и они были выписаны домой на 4—6-й день (5,0±0,1). Ранний неонатальный период протекал без осложнений. Матери здоровых новорожденных были включены в 4-ю группу. Все они, за исключением одной женщины с хроническим бронхитом, были здоровы; беременность и роды у 18 женщин протекали физиологически, у 3 — осложнились анемией, токсикозом беременных и слабостью родовой деятельности. Во 2-ю группу вошли 6 здоровых детей (оценка по шкале Апгар —7—8 баллов, через 5 мин — 8—9 баллов), с различными    реакциями      адаптации (физиологическая диспепсия — у 4, токсическая эритема — у 2), которые были купированы к моменту выписки домой на 4—6-й день (5,1±0,4). Ма­тери этих детей составили 5-ю группу. Из них одна женщина перенесла пие­лонефрит, у 2 — произошло    прежде­временное отхождение вод. В 3-ю группу вошли 11 новорожденных с явлениями дезадаптации гипоксически-травматического генеза. Асфиксию средней тяжести    перенесли 8 детей, внутриутробную гипоксию —3. При рождении оценка по шкале Апгар в 4—5 баллов была дана 2 детям, в 6— 7 баллов —9.   4 ребенка родились в состоянии гипотрофии I степени, 2 — с признаками незрелости, один — пу­тем кесарева сечения. У 8 новорожден­ных в первые дни жизни отмечались клинические проявления нарушения мозгового кровообращения   III сте­пени, у 2 — вегетовисцеральных   дис­функций. На 3—5-й день жизни со­стояние детей в основном стабилизи­ровалось, лишь в отдельных случаях имели место умеренный акроцианоз, мышечная дистония,     гипорефлексия, срыгивания и  неустойчивость стула. Все дети после соответствующего ле­чения были выписаны домой на 5— 9-й день (7,1 ±0,5). Матери новорож­денных были включены в 6-ю группу. У 10 из 11 женщин течение беремен­ности и родов было осложнено вегето-сосудистой дистонией  (2),      анемией (1), токсикозом беременных (2), преждевременным отхождением вод  (7), слабостью родовой деятельности (1).

Содержание эндотоксина изучено у 38 новорожденных, из них 19 детей обследовано однократно, 14 —двукратно и 5 — трехкратно (проведено 62 анализа). Гликолипидные антитела выявлены у 38 детей (61 анализ), ан­титела к эшерихиям — у 34  (54)  и к золотистому стафилококку—у 29 (51). Матерей обследовали однократно, не­которых - двукратно.

Эндотоксин определяли ЛАЛ-тестом [10, 11], позволяющим оценивать ре­акцию при концентрации эндотоксина 0,1 пг/мл [16]. Лабораторную посуду в алюминиевой фольге прогревали 3 ч при 300°. Капиллярную кровь   брали после обработки кожи метанолом, эта­нолом и апирогенной водой, добавляли гепарин (10—15 ЕД/мл),   сразу ох­лаждали до 4° и центрифугировали при 1000Xg в течение 10 мин. Ампу­лы с образцами плазмы закрывали парафильмом и    замораживали    при —20°. Срок хранения   не   превышал 2 месяца. Перед     постановкой теста контрольные и опытные образцы раз­водили апирогенной    водой    (1 : 10), прогревали 10 мин в водяной бане при 80°, охлаждали,    добавляли равный объем разведенного водой лизата амебоцитов и полученную смесь инку­бировали 45 мин в   термостате   при 37°. Выраженность реакции оценивали визуально [10, 16] и с помощью мик­роскопа на основе    разработанного нами метода кристаллографии. Сте­пень полимеризации и кристаллизации субстрата в опытных и   контрольных образцах сравнивали с известным со­держанием стандартного эндотоксина (пирогенала), растворенного в апиро­генной донорской плазме. В зависимо­сти от состояния геля и дисперсности кристаллической  сетки,  образованной белковым лизатом в инертном разво­дящем растворе, различали образцы с содержанием эндотоксина 2,5—5—10— 15—20 пг/мл (рис.1), что соответст­вовало  общепринятым   10 качествен­ным критериям от (+-) до (3+). Чувствительность ЛАЛ-теста — 2,5 пг/мл эндотоксина в плазме,    разве­денной   апирогенной водой (1 : 10). Плотный гель образовывался при кон­центрации эндотоксина 20 пг/мл и выше. Результаты реакции после спе­циальной обработки документировали.

Рис. 1. Дисперсность кристаллической сетки в ЛАЛ-тесте в зависимости от концентрации токсина в плазме крови А—0 пг/мл, Б — 2,5 пг/мл, В — 5 пг/мл, Г —10 пг/мл, Д—15 пг/мл, Е — 20 пг/мл и больше. На участке Е — аморфная масса геля в виде темных пятен, деструкция сетки и свободные от белка зоны — в правом нижнем углу (ув. 7X20).

Титры гликолипидных антител опре­деляли методом тонкослойного иммунного анализа [4, 12, 13] на основе подобранных нами оптимальных условий реакции и учета результатов.    Поли­стироловые чашки Петри  сенсибилизировали    Re-гликолипидом штамма Salmonella minnesota R 595. Свободные сайты насыщали    1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Реакцию проводили 16—18ч  в 1% агаре Дифко. Титр антител оценивали по диаметру зоны специфического крупнокапельного конденсата:      1:2 — до 0,9 мм;    1 : 4 —до 1,9 мм;    1 : 8 — до 2,9 мм; 1 : 16 — до 3,9 мм; 1 : 32 — до 4,9 мм; 1 : 64 — до 5,9 мм; 1 : 128 — до 6,9 мм и 1 : 256 — до 7,9 мм. В качестве контрольных образцов использовали гипериммунную плазму, истощен­ную на колонках,   сенсибилизированных Re-гликолипидом (рис. 2).   При параллельном    определении в  10 образцax плазмы    гликолипидных антител с помощью тонкослойного иммунного анализа  (ТИА), реакций прямой агглютинации   (РПГЛ)   и   иммуноферментного  анализа  наблюдалось совпадение результатов, но по чувствительности ТИА превосходил РПГА в 8 - 10 раз и на 2 порядка уступал иммуноферментному методу. Для постановки всех реакций требовалось 0,2 мл капиллярной крови.

Рис. 2. Зоны специфической конденсации паров при проведении тонкослойного иммун­ного анализа. K1— гипериммунный образец, К2— отрицательный контроль. А, Б, В — опыт­ные образцы плазмы.

При определении методом ТИА титров антител против стафилококков и кишечной палочки использовали коммерческие термостабильные фрак­ции фильтратов 5—6 суточных буль­онных культур, которые содержали общие для исследуемых родов, бакте­рии антигенные детерминанты.

Результаты исследований представ­лены в таблице. Содержание эндоток­сина у новорожденных с адаптацион­ными реакциями (2 и 3-я группы) бы­ло выше, чем у здоровых детей. Эндотоксинемия при гипоксии (3-я группа) развивалась на фоне   низких   титров гликолипидных антител.    При физио­логических реакциях    адаптации (2-я группа) титры энтеробактериальных антител у детей и у их матерей (5-я группа) превышали контрольные по­казатели. Эндотоксинемия у матерей новорожденных, перенесших асфик­сию, была более выраженной, чем у матерей здоровых детей.

При обследовании 19 новорожден­ных из различных групп в динамике адаптационного периода колебания со­держания эндотоксина (повышение или снижение)  выявлены у 12 детей: в 1-й   группе — у   2 (в   пределах 5 пг/мл), во 2-й — у 3 (15 пг/мл),   в 3-й — у 7 (20 пг/мл). Диагностическое (4-кратное) изменение титров антител к  гликолипиду (исследовали   парные образцы плазмы у 19 детей различных групп), кишечной палочке (у 16) и зо­лотистому стафилококку (у  13)  уста­новлено соответственно у 9,5 и 6 ново­рожденных.

Содержание эндотоксина (пг/мл)  и антител  (обратные титры) Re-гликолипиду, эшерихиям и золотистому стафилококку в плазме новорожденных и их матерей (М±m)

 

Обследованные

Группы

Содержание

эндотоксина, пг/мл

антител (обратные титры)

к Re-гликолипиду

к эшерихиям

к золотистому стафилококу

Новорожденные

1-ая

1,2±0,4 (26)

22,9±3,1 (26)

10,1±1,5 (25)

11,0±1,9 (24)

2-ая

6,0±1,5* (13)

60,3±10,1*(13)

24,3±6,1*(12)

9,8±1,9 (12)

3-ая

8,2±1,2* (23)

10,2±2.3*(22)

7,3±1,9 (17)

8,0±2,1 (15)

Матери

4-ая

2,4±0,9 (21)

16,4±2,6 (22)

10,4±1,9 (22)

9,1±1,7 (21)

5-ая

1,3±0,5 (8)

96,0±26,4**(8)

38,9±9,1**(7)

6,9±2,6 (7)

6-ая

6,8±1.9**(11)

47,3±14,9 (12)

23,7±6,0 (12)

14,6±3,4 (10)

 

 

Примечание. В скобках — количество исследований. * Р<0,06 по отношению к 1-й группе, **Р<0,05 по отношению к 4-й группе.


Эндотоксинемия у здоровых ново­рожденных, видимо, связана с разви­тием    транзиторного     дисбактериоза и сохраненных компенсаторных возможностей организма, что подтверждается достаточно высоким и стабильным уровнем антител при благоприятном течении периода адаптации. Более выраженная   эндотоксинемия при ограничных   состояниях,    вероятнее всего,   обусловлена   физиологической диспепсией. У 2 детей с   токсической эритемой нельзя было исключить повышенную чувствительность к эндотоксину. Развитие эндотоксинемии на фоне высоких титров антител против энтеробактерий указывает на дисфункцию других систем детоксикации [14]. Повышенное содержание эндотоксина на фоне низких титров гликолипидных антител у новорожденных, перенесших асфиксию, даже с учетом индивидуальных колебаний, в целом по группе свидетельствует о причинной взаимосвязи этих показателей и, видимо, отражает характерные для таких состоя­ний  общие   процессы   дезадаптации при     неблагоприятном акушерском анамнезе, в частности дисбиотические изменения в желудочно-кишечном тракте  [2]. Нарастание титров анти­тел у детей этой группы связано с компенсаторными возможностями организ­ма при нетяжелых формах асфиксии [7], что подтверждалось быстрым ку­пированием симптомов и выпиской де­тей домой. Динамика титров антител против эшерихий и золотистых стафи­лококков свидетельствовала о физио­логических реакциях системного им­мунитета и указывала на этиологическое значение этих бактерий при адап­тации, хотя в случаях повышения тит­ров нельзя исключать и адьювантный эффект эндотоксина, что требует специального изучения (рис. З).

Эндотоксинемия у матерей с неблагоприятным акушерским анамнезом (6-я группа), видимо, является след­ствием активации грамотрицательной аутофлоры [9], что подтверждалось высоким уровнем антител против энтеробактерий у матерей новорожден­ных с компенсированными формами адаптационных реакций (5-я группа).

Выявленные нами высокие титры антител к гликолипиду у новорожден­ных при гладком течении раннего пе­риода адаптации и низкие титры при неблагоприятном акушерском анамне­зе и дезадаптации позволяют рассмат­ривать их значения в прогностических целях при оценке резистентности ор­ганизма.


Рис. 3. Динамика титров антител против Re-гликолипида (а), эшерихий1), стафило­кокков 2) и концентрации эндотоксина (б) в плазме крови у новорожденного П., пере­несшего асфиксию I степени.

По оси абсцисс—время после рождения в  сутках (до выписки домой), по оси орди­нат— обратные значения титров (А) и кон­центрация эндотоксина в пг/мл. (Б). Столби­ки — соответствующие средние показатели у здоровых новорожденных.

ВЫВОДЫ

1.  Впервые обнаружено развитие физиологической эндотоксинемии у новорожденных. Течение периода ран­ней неонатальной адаптации зависит от содержания в плазме крови детей эндотоксина и антител к Re-гликолипиду энтеробактерий.

2.            У матерей новорожденных, пере­несших асфиксию, на фоне неблагоприятного акушерского анамнеза со­держание эндотоксина повышается по сравнению с матерями здоровых де­тей.

3.            Оценка общей резистентности ор­ганизма новорожденного возможна по содержанию антител к Re-гликолипида энтеробактерий.

4.            Дисперсность кристаллической сетки в ЛАЛ-тесте зависит от кон­центрации эндотоксина в плазме крови.

ЛИТЕРАТУРА

1.     Аполлонин А. В., Лиходед В. Г., Се­вастьянова Е. К.// Журн. микробиол.—1989.— № 2.—С. 96-100.

2.    Гаврилов А. И.//Вопр. охр. мат.—1988.— № 4— С. 46—47.

3. Гаврюшов В. В., Сотникова К. А. Неонатология.—Л., 1985.

4.    Иммунологическая диагностика вирусных инфекций (под ред. Т. В. Перадзе, П. Халонена).— М., 1985.

5.     Сергеев О. Е., Головина Н. М. Кишечные инфекции у новорожденных детей: Медицина и здравоохранение. Серия «Педиатрия».—М., 1989.— Вып. 2.— С. 60.

6.     Шабалов Н. П., Ходов Д. А., Санталова Ф. П. и др. Неонатология,—М., 1988.

7.           Шабалов Н. П., Ярославский В. К., Ходов Д. А., Любименко В. А. Асфикция новорожденных.—Л., 1990.

8.     Яковлев М. Ю.//Казанский мед. ж.—1988.—№ 5.—С. 353—358.

9.     Bhakoo О. N., Singh M.//Indian J. Pediatr.—1988.—Vol.   55.—P.   941—946.

10.    Bode C, Kugler V., Bode J. C.//J. Hepatol.—1987.—Vol. 4.—P. 8—14.

11.    Cox M. С. MD, MacDonald P. С. MD, Casey M. L Ph. D.//Am. J. Obstet Cynecol.— 1988.—Vol. 159.—P; 99—106.

12.    Elwing H., Lange S., Nygren H.//J. Im­munol.  Meth.,— 1980.— Vol.  39.—P.  247—256.

13.    Elwing H., Nilsson L.A. Ouchterlony O.//J. Immunol. Meth.— 1980.— Vol. 38.— P. 257—268.

14.    Olson N. C, Salzer W. L., McCall С. E// Mol. aspects med.—1988.—Vol. 10.—P. 511-629.

15.    Philippe J. J., De Buyzere M. L.//Acta Clinica Belgica.—1988.—Vol. 43.—P. 429— 436.

16.    Roth R. I., Levin J., Behr S. J.//Lab. clin.. Med.—1989.—Vol.  114.—P. 306-311.

Поступила   27.11.91.

ENDOTOXINEMIA    IN EARLY PERIOD OF ADAPTATION IN INFANTS AND THEIR MOTHERS

R. A. Urazaev, A. N. Krupnik,, M. Yu. Yakovleo

Summary

Endotoxin concentration is determined in blood plasma in 37 infants, and antibody ti­ter to Re-glycolipid of enterobacteria, escherichia and goldish staphylococci is investigated by thin-layered immune analysis. The deve­lopment of physiologic endotoxinemia is sta­ted and the dependence of the content of en­dotoxin and titers of Re-antibodies in infants on the course of early period of adaptation and
health   state   of   their   mothers.